The structure and expression of the pyruvatekinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger

L.H. de Graaff

Research output: Thesisinternal PhD, WU

Abstract

Dit proefschrift "Het pyruvaat kinase gen en zijn expressie in Aspergillus nidulans en Aspergillus niger " beschrijft het onderzoek naar de structuur en expressie van het pyruvaat kinase gen in deze schimmels.

De doelstelling van dit onderzoek was de opheldering van de genstructuur van het pyruvaat kinase gen, vergelijking met de genstructuur van het overeenkomstige gen uit andere organismen, en de studie naar de expressie van het genproduct, pyruvaat kinase.

De pyruvaat kinase genen van A.nidulans en A.niger zijn geisoleerd met behulp van heterologe hybridizatie, waarbij het sterk overeenkomstige pyruvaat kinase gen uit gist gebruikt is om beide genen op te sporen. De identiteit en functionaliteit van het pyruvaat kinase gen uit A.nidulans is onderzocht door een transformatie systeem te ontwikkelen, gebaseerd op een pyruvaat kinase mutant. Deze mutanten kunnen niet groeien op media met een glycolytische koolstofbron, zoals glucose of sucrose. Als gevolg hiervan kunnen transformanten, die een functioneel gen in hun genoom geïntegreerd hebben, op deze media geselecteerd kunnen worden.

Het A.nidulans pyruvaat kinase gen is gelocaliseerd op een 2,9 kb EcoRI/ Bam HI fragment. Transformatie van A.nidulans WG231, met een zodanige mutatie in het pyruvaat kinase gen, dat geen pyruvaat kinase eiwit meer gevormd wordt, leidt tot volledig herstel van de pyruvaat kinase activiteit. Er wordt een rechtstreeks verband gevonden tussen het aantal kopiëen van dit fragment dat in het genoom geïntegreerd is, en de gemeten pyruvaat kinase activiteit. Hieruit wordt geconcludeerd dat het genoemde fragment het gehele gen bevat, inclusief de gebieden op het DNA die betrokken zijn bij de expressie. Hoewel het gen gereguleerd wordt afhankelijk van aangeboden koolstofbron, zijn er aanwijzingen gevonden dat er regulerende DNA sequenties ontbreken in dit 2,9 kb EcoRI/ Bam HI fragment. Uit de gevonden waarden van de pyruvaat kinase activiteit na groei op een gluconeogenetische koolstofbron als acetaat, welke in de transformanten verhoogd is ten op zichte van die in de wild type stam, wordt geconcludeerd dat de gen activiteit gereguleerd wordt door repressie van de expressie.

Na transformatie wordt het transformerende DNA in ongeveer 90% van de gevallen geïntegreerd aangetroffen op de plaats van het pyruvaat kinase gen binnen het genoom. Slechts bij uitzondering vindt integratie op een andere, willekeurige plaats in het genoom plaats. Dit komt overeen met de resultaten, zoals die door andere onderzoekers gevonden worden, namelijk dat hoofdzakelijk homologe integratie plaats vindt daar waar rechtstreeks op de betreffende genetische eigenschap geselecteerd wordt. De hier omschreven resultaten en conclusies, worden beschreven in hoofdstuk 2.

Het pyruvaat kinase eiwit uit A.nidulans is geïsoleerd uit de wild type stam, en uit een transformant met een verhoogde expressie, ten gevolge van een hoger aantal copiën van het pyruvaat kinase gen. Dit eiwit is gedeeltelijk gekarakteriseerd, en beschreven in hoofdstuk 3. Karakteristieken van het eiwit, zoals het molekuulgewicht en de aminozuursamenstelling, zijn vergeleken met waarden welke zijn afgeleid zijn uit de basenvolgorde in het coderende gebied van het gen. Voor deze karakteristieken is een goede overeenkomst gevonden (hoofdstuk 4). Het gen codeert voor een eiwit bestaande uit 526 aminozuren, dat sterke homologie vertoont met pyruvaatkinase uit gist en zoogdieren.

De coderende sequentie van het pyruvaat kinase gen, wordt onderbroken door zeven intronen. Deze worden niet gelijkmatig verdeeld binnen de coderende sequentie gevonden, maar voornamelijk aan het begin van het gen, het S' uiteinde. De positie van deze intronen, is vergeleken met de positie van de intronen in de pyruvaat kinase genen afkomstig uit onder andere kip, en rat. Uit deze vergelijking blijkt dat drie van de zeven intronen in het A.nidulans gen, in dezelfde, of in een vrijwel gelijke positie gevonden wordt. Het aantal en de lengte van de intronen in het pyruvaat kinase gen van A.nidulans reflecteert de intermediaire positie welke Aspergilli in de evolutie innemen, tussen lagere eukaryoten zoals gist enerzijds en de hogere eukaryoten, zoals kat, kip en rat anderzijds.
Het pyruvaat kinase gen van A.niger is op soortgelijke wijze geisoleerd als dat van A.nidulans (hoofdstuk 5). De functionaliteit van dit gen is aangetoond door middel van co-transformatie, waarbij het pyrA gen uit A.niger gebruikt is als selectie marker. In de gevonden transformanten werden verhoogde expressie niveau's gevonden, tot het dertigvoudige van het wild type niveau. In alle gevallen blijkt het pyruvaat kinase gen in dit geval op een willekeurige plaats in het genoom geintegreerd te zijn, mogelijk als gevolg van de gekozen experimentele condities.

Evenals het A.nidulans gen wordt het A.niger gen onderbroken door zeven intronen, die weliswaar verschillen in lengte van die in A.nidulans maar zich op identieke posities in het gen bevinden. Beide Aspergillus genen vertonen zeer veel overeenkomst; ongeveer 90% van zowel de basen volgorde als de aminozuur volgorde is identiek, terwijl ook het totaal aantal aminozuren gelijk is, namelijk 526.

In hoofdstuk 6 wordt de ruimtelijke structuur van het pyruvaat kinase gen uit Aspergillus beschreven. Deze ruimtelijke structuur is afgeleid uit de structuur van het kattespier pyruvaat kinase. De vergelijking van belde structuren toont verschillen aan m.b.t. de fructose 1,6-bifosfaat bindingsplaats en op het niveau van subeenheid interacties. Met dit laatste is een mogelijke correlatie vastgelegd tussen allosteer en niet allosteer gereguleerde pyruvaat kinase vormen. Op grond van de ruimtelijke structuur wordt verder gepostuleerd dat fosforylering van het pyruvaat kinase uit Aspergillus onwaarschijnlijk is.

Original languageEnglish
QualificationDoctor of Philosophy
Awarding Institution
Supervisors/Advisors
  • van Kammen, A., Promotor, External person
  • Visser, J., Promotor
Award date19 Apr 1989
Place of PublicationS.l.
Publisher
Publication statusPublished - 1989

Keywords

  • aspergillus
  • molecular genetics

Cite this