The role of MgATP in nitrogenase catalysis

Naast water bepaalt de hoeveelheid stikstof die in de bodem aanwezig is in de meeste gevallen de produktiviteit van de landbouwgebieden op aarde. Het is van belang dat stikstof in een voor de plant bruikbare vorm beschikbaar is. op het eerste gezicht lijkt het vreemd dat er een tekort aan stikstof kan optreden, omdat 80% van de lucht om ons heen uit stikstofgas bestaat. Maar voor nagenoeg alle vormen van leven is de stikstof zoals die in de lucht voorkomt, namelijk als het molekuul N ₂ , niet bruikbaar. Planten en de meeste mikroorganismen verkrijgen hun stikstof in het algemeen uit verbindingen zoals ammonia (NH ₃ ) en nitraat (NO ₃ ). Dieren verkrijgen de stikstof die ze nodig hebben om te kunnen groeien en funktioneren door het eten van planten en andere dieren. De reden waarom elk levend wezen stikstof nodig heeft is gelegen in het feit dat twee van de meest essentiële bestanddelen van de cel stikstof bevatten, namelijk eiwitten en nucleïnezuren (DNA, RNA). Slechts een beperkt aantal mikroorganismen is in staat om stikstofgas uit de lucht (N ₂ ) om te zetten in ammonia. Dit proces noemt men stikstofbinding. Ammonia wordt als N-bron gebruikt voor de synthese van stikstofhoudende verbindingen. De stikstofbindende bakteriën komen in allerlei vormen voor, maar de belangrijkste voor de landbouw zijn die bakteriën die in de wortelknolletjes van vlinderbloemige planten leven in symbiose met de plant. Zonder de wetenschappelijke achtergrond te kennen maakten de Romeinen reeds gebruik van zogenaamde wisselbouw, dit wil zeggen, door het afwisselend verbouwen van vlinderbloemige gewassen als klaver en erwteplanten en niet-vlinderbloemige gewassen zoals graan, werd de vruchtbaarheid van de bodem op peil gehouden. Het duurde echter nog tot in de 19e eeuw voordat ontdekt werd dat wortelknollen bakteriën bevatten die stikstof uit de lucht om kunnen zetten in een stikstofverbinding die door de plant gebruikt kan worden.

In de huidige, intensieve landbouwgebieden wordt voor een belangrijk deel gebruik gemaakt van (stikstof) kunstmest om aan de stikstofbehoefte van de plant te kunnen voldoen. De Industriële produktie van kunstmest gebeurt volgens het Haber-Bosch proces: uitgaande van de grondstoffen N ₂ en H ₂ wordt bij hoge druk (350-1000 atmosfeer) en een hoge temperatuur (±350°C) ammonia gevormd In aanwezigheid van een ijzer bevattende katalysator. Door de hoge energiekosten die gepaard gaan met dit proces, evenals de hoge investeringskosten die nodig zijn voor het opzetten van een kunstmestfabriek (het is alleen grootschalig ekonomisch uit te voeren) en de noodzaak van opslag en transport van het geproduceerde kunstmest, is de produktie van kunstmest en dus het gebruik ervan in de landbouw voor de meeste ontwikkelingslanden ekonomisch niet haalbaar. Om het toenemende aantal mensen op deze wereld van voedsel te kunnen voorzien is het echter nodig dat de landbouwproduktie toeneemt. Dit houdt in dat ook de stikstofgift aan de bodem drastisch moet stijgen. Aangezien de huidige methoden van kunstmestproduktie gebruik maken van niet onuitputtelijke bronnen van energie (fossiele brandstoffen), is het belangrijk dat onderzoek gedaan wordt met als doel de biologische stikstoffixatie te verbeteren, zodat het gebruik van kunstmest beperkt kan blijven. Biologische stikstofbinding is een proces dat gedreven wordt door een onuitputtelijke energiebron namelijk zonlicht. Bovendien wordt het biologisch gebonden stikstof efficiënt gebruikt en spoelt niet direkt uit.

Het enzym, dat in stikstofbindende bakteriën de omzetting van N ₂ in NH ₃ katalyseert noemt men nitrogenase. Het in dit proefschrift beschreven onderzoek heeft zich voornamelijk gericht op het werkingsmechanisme van dit enzym. Omdat de eigenschappen van nitrogenase uit de verschillende soorten stikstofbindende bakteriën nauwelijks verschillen, en omdat de bakterie Azotobactervinelandii gemakkelijk op grote schaal gekweekt kan worden, zijn de in dit proefschrift beschreven eksperimenten uitgevoerd met nitrogenase uit deze bakterie. Tijdens de zuivering van nitrogenase wordt het enzym in twee komponenten gescheiden, vaak aangeduid met komponent 1 en komponent 2. Beide komponenten zijn nodig voor de omzetting van N ₂ in NH ₃ . Verder zijn er voor de reduktie van N ₂ tot NH ₃ , ATP en een sterk reduktiemiddel nodig.

In het Haber-Bosch proces wordt de energie die nodig is om het inert N ₂ molekuul te reduceren geleverd door een hoge temperatuur. Daarentegen vindt de omzetting van N ₂ in NH ₃ door het enzym nitrogenase plaats bij kamertemperatuur. ATP is hierbij de leverancier van de benodigde energie. ATP is een in de cel voorkomende energierijke verbinding. Deze vastgelegde energie kan gebruikt worden in energie vereisende reakties. Hierbij wordt een fosfaatgroep afgesplitst en ontstaat er ADP. Voor de omzetting van één molekuul N ₂ in twee molekulen NH ₃ is de hydrolyse van 16 molekulen ATP nodig. De omzetting van N ₂ in NH ₃ , en ook de hydrolyse van ATP, treedt alleen op wanneer beide komponenten van nitrogenase aanwezig zijn. De afzonderlijke komponenten kunnen geen ATP hydrolyseren.

In de hoofdstukken 2 en 3 staan de eigenschappen beschreven van de binding van ATP en ADP aan komponent 2. Komponent 1 bindt geen adenine nukleotiden. De elektronen die nodig zijn voor de omzetting van N ₂ in NH ₃ worden via komponent 2 naar komponent 1 getransporteerd. Men neemt aan dat de substraat reduktie plaatsvindt op komponent 1 van nitrogenase. De hydrolyse van ATP tijdens de nitrogenase reaktie vindt plaats wanneer een elektron wordt overgedragen van komponent 2 naar komponent 1. Omdat er geen elektronen-overdracht plaatsvindt in afwezigheid van ATP, wordt aangenomen dat de ATP hydrolyse nodig is voor deze elektronen-overdrachtsreaktie. In hoofdstuk 4 wordt aangetoond dat nitrogenase ook ATP hydrolyseert wanneer er geen elektronen-overdracht tussen beide komponenten plaatsvindt. Dit was een eerste aanwijzing dat de ATP hydrolyse mogelijk nog een andere funktie heeft behalve een direkte deelname in de elektronenoverdrachtsreaktie. Een tweede aanwijzing werd verkregen uit eksperimenten waarin aangetoond werd dat, alhoewel komponent 2 slechts twee bindingsplaatsen bezit voor ATP, er vier molekulen ATP binnen 60 millisekonden gehydrolyseerd worden door het nitrogenase kompleks. Dit suggereert dat er twee ekstra ATP bindingsplaatsen ontstaan, wanneer komponent 1 en komponent 2 een kompleks vormen. Deze ATP's zouden mogelijk rechtstreeks betrokken kunnen zijn bij de omzetting van N ₂ in NH ₃ op komponent 1.

In hoofdstuk 5 wordt verder Ingegaan op de betrokkenheid van ATP in de nitrogenase reaktie. In het huidige model wordt aangenomen dat de langzaamste stap van de nitrogenase katalyse de snelheid is waarmee het nitrogenase kompleks verplicht moet dissociëren na de overdracht van elektronen van komponent 2 naar komponent 1. De eksperimenten beschreven in hoofdstuk 5 suggereren dat de snelheidsbepalende reaktiestap onder bepaalde kondities anders is, namelijk de dissociatiesnelheid van ADP van Av ₂ .

Omdat een aantal kenmerken van de ATP hydrolyse door nitrogenase terug te vinden zijn in die van een ander eiwit dat ATP hydrolyseert/synthetiseert, de zogenaamde proton ATPase, worden in hoofdstuk 6 de mogelijke overeenkomsten tussen beide eiwitten wat betreft het mechanisme van ATP hydrolyse bediskussieerd.