Nodulins in root nodule development

Research output: Thesisinternal PhD, WU

Abstract

In de bodem zijn Rhizobium bacteriën in staat de wortels van vlinderbloemige planten (erwt, boon, klaver) te infecteren en aan te zetten tot de vorming van knolletjes. In die wortelknolletjes zijn de bacteriën in staat om stikstof uit de lucht te binden en om te zetten in ammonia. Met de ammonia kan de plant zich in belangrijke mate voorzien in haar stikstofbehoefte. Op hun beurt krijgen de bacteriën voedingsstoffen van de plant, zodat beide partners profiteren van deze symbiose.

Een stikstofbindende wortelknol is een uiterst gespecialiseerd plante-orgaan, dat gevormd wordt in een aantal opeenvolgende stappen, waarin rhizobia de plant binnendringen, en deze aanzetten tot de vorming van een wortelknolstructuur. Uiteindelijk vullen de Rhizobium bacteriën ongeveer de helft van de cellen in de wortelknol, veranderen van vorm en beginnen vervolgens met de stikstofbinding. Gedurende dit proces wisselen plant en bacterie waarschijnlijk voortdurend signalen uit om het goede verloop van het proces te bewerkstelligen.

Het onderzoek naar het mechanisme van wortelknolvorming en stikstofbinding op moleculair niveau heeft een hoge vlucht genomen. Zowel in de bacterie als in de plant zijn genen geïdentificeerd, die alleen in de wortelknol tot expressie komen. Rhizobium bacteriën bezitten naast hun chromosoom een zogenaamd sym plasmide, waarop de genen liggen die betrokken zijn bij de symbiose. Geïdentificeerd zijn de genen voor wortelknolvorming ( nod genen) en stikstofbinding ( nif en fix genen). Over de functie van de genproducten en de regulatie van de expressie van deze genen is veel bekend, maar wat met name de ( nod genen precies teweegbrengen is nog onduidelijk.

Een twintig- tot dertigtal genen van de plant komen uitsluitend in de wortelknol tot expressie; dit zijn de zogenaamde noduline genen. Onderzoek naar de expressie van noduline genen in relatie tot de ontwikkeling van de wortelknol heeft laten zien dat er tenminste twee klassen noduline genen onderscheiden kunnen worden: vroege en late noduline genen. De vroege noduline genen komen ruim voor de stikstof-binding tot expressie, als het orgaan de wortelknol wordt aangelegd. Vroege nodulines spelen daarom waarschijnlijk een rol bij het vormen van de structuur van de wortelknol. Late noduline genen komen tot expressie rond het tijdstip dat de wortelknol met stikstofbinding begint. Het is dan ook aannemelijk dat late nodulines betrokken zijn bij het functioneren van de wortelknol. Mogelijk scheppen zij de voorwaarden voor stikstofbinding en het transport van gebonden stikstof. Omdat de late noduline genen min of meer tegelijkertijd tot expressie komen, is het waarschijnlijk dat deze genen op één en dezelfde wijze worden gereguleerd.

Het merendeel van de noduline genen die tot nu toe geïdentificeerd zijn, behoort tot de klasse van late noduline genen. Het best bestudeerde late noduline is leghemoglobine, een myoglobine- achtig eiwit dat de zuurstofhuishouding in de wortelknol regelt. Van slechts een gering aantal van de overige nodulines is de functie in de wortelknol bekend. Ook over de manier waarop de plant ervoor zorgt dat noduline genen op het juiste moment en op de juiste plaats, dus alleen in de wortelknol, tot expressie komen, en over de rol van de Rhizobium bacteriën bij dit proces, is de kennis nog gering.

Dit proefschrift beoogt een bijdrage te leveren aan de kennis over nodulines en noduline genexpressie. De beschreven experimenten hebben tot doel inzicht te krijgen in het mechanisme van de regulatie van noduline genexpressie. Vooral de rol van Rhizobium genen bij de inductie van noduline genexpressie staat daarbij centraal. Anderzijds komt ook de functie van vroege nodulines tijdens de vorming van een wortelknol ter sprake.

Na een korte algemene inleiding over wortelknolvorming (hoofdstuk een) wordt in hoofdstuk twee een cDNA kloon beschreven die een vroeg noduline gen representeert. Deze cDNA kloon, pGmENOD2, is geïsoleerd uit een cDNA bank gemaakt tegen wortelknoIRNA van soja. Het ENOD2 DNA blijkt te coderen voor een noduline met een molecuulgewicht van 75.000, aangeduid met Ngm-75. De aminozuurvolgorde van dit noduline, afgeleid uit de DNA sequentie, laat zien dat Ngm-75 een zeer proline-rijk eiwit is, met een repeterend motief in zijn primaire structuur. Dit duidt erop dat Ngm-75 een structureel eiwit zou kunnen zijn. Het gen dat codeert voor Ngm-75 komt tot expressie in wortelknol-achtige structuren, die weliswaar door Rhizobium bacteriën geïnduceerd zijn, maar waarin geen bacteriën aangetroffen worden, zogenaamde 'lege' knollen. Ngm-75 lijkt daarom geen functie te hebben in het proces waarbij de Rhizobium bacteriën de plant binnendringen, maar eerder lijkt dit vroege noduline een bijdrage te leveren aan de vorming van de wortelknolstructuur.

In hoofdstuk drie wordt de regulatie van de expressie van late noduline genen op het niveau van het DNA onder de loep genomen. Leghemoglobine cDNA kloons, geïsoleerd uit een cDNA bank gemaakt van wortelknoIRNA van de erwt, zijn gebruikt om een leghemoglobine gen te isoleren uit een genomische bank gemaakt van erwteDNA. Van dit leghemoglobine gen van de erwt is de DNA sequentie bepaald. Uit de analyse van deze sequentie blijkt dat het geïsoleerde gen volledig is en alle kenmerken bezit van een actief gen. De vergelijking van de promotergebied van het uit de erwt geïsoleerde leghemoglobine gen met de promotergebieden van soja leghemoglobine genen laat zien dat er overeenkomstige sequenties voorkomen. Omdat de overeenkomstige sequenties ook worden aangetroffen in de promotergebieden van andere late noduline genen, zijn deze sequenties wellicht betrokken bij de wortelknolspecifieke expressie van alle late noduline genen.

In de hoofdstukken vier en vijf staat de communicatie tussen plant en bacterie centraal. Gepoogd wordt te achterhalen welke genen van Rhizobium betrokken zijn bij het aanschakelen van noduline genen. Hierbij is gebruik gemaakt van de mogelijkheden die de bacteriële genetica biedt om bacteriën te construeren die weliswaar een gedefiniëerd deel van het totale Rhizobium genoom missen, maar toch nog wortelknollen kunnen induceren. Deze studies zijn uitgevoerd met wikke ( Vicia sativa subsp. nigra ), omdat dit kleine vlinderbloemige plantje snel reageert op inoculatie met (genetisch veranderde) Rhizobium bacteriën. In hoofdstuk vier is de basis gelegd voor de analyse door het identificeren van de noduline genen van wikke. Uit wortelknollen werd RNA geïsoleerd, en in vitro vertaald in eiwitten, welke werden gescheiden op tweedimensionale polyacrylamide gels. Door het vergelijken van het aldus verkregen eiwitpatroon met dat van worteIRNA zijn vijftien noduline mRNAs geïdentificeerd, waaronder één vroeg noduline mRNA. Een tweede vroeg noduline mRNA van wikke is geïdentificeerd op Northern blots met behulp van de in hoofdstuk twee beschreven soja cDNA kloon pGmENOD2.

De expressie van de noduline genen van wikke is vervolgens bestudeerd in wortelknollen geïnduceerd door een Rhizobium stam waarin het sym plasmide is vervangen door een plasmide met alleen 12 kb van het nod gebied. Alle noduline genen bleken tot expressie te komen. Kennelijk speelt de informatie op het sym plasmide buiten deze 12 kb nod gebied geen enkele rol bij de inductie van noduline genexpressie. In wortelknollen geïnduceerd door een Agrobacterium transconjugant, waarin het Ti plasmide is vervangen door dezelfde 12 kb van het nod gebied, bleken alleen de twee vroege noduline genen tot expressie te komen. Het nod gebied is dus het enige Rhizobium DNA dat betrokken lijkt te zijn bij de inductie van vroege noduline genexpressie. Hoewel dit resultaat tegelijkertijd suggereert dat het Rhizobium c hromosoom betrokken moet zijn bij de inductie van late noduline gen expressie, mag die conclusie niet zomaar getrokken worden, want cytologisch onderzoek laat zien dat de Agrobacterium transconjugant een afweerreactie van de plant oproept. Het is dus mogelijk dat de genen op het nod gebied weliswaar in staat zijn om late noduline genen aan te schakelen, maar dat de verdere ontwikkeling van de wortelknol al gestopt is door de tussenkomst van het afweermechanisme, vóórdat die late noduline genen aangeschakeld konden worden. Agrobacterium transconjuganten zijn dus niet bruikbaar om de rol van de nod genen bij de inductie van late noduline genexpressie te onderzoeken.

In hoofdstuk vijf worden experimenten besproken die, zij het indirect, laten zien dat de nod genen inderdaad betrokken zijn bij de expressie van late noduline genen. Gezien het fenotype van mutaties in de diverse nod genen aanwezig in de 12 kb van het nod gebied zijn het waarschijnlijk de nodA , B en C genen, die één of meer signalen aan de plant geven, waardoor de expressie wordt geïnduceerd van de vroege en vervolgens mogelijk ook van de late noduline genen.

Uit bovenstaande experimenten bleek dat er een correlatie bestaat tussen de ontwikkeling van een wortelknol, zoals die op microscopisch niveau gevolgd kan worden, en de expressie van noduline genen. De correlatie tussen de expressie van een bepaald noduline gen en het bereiken van een bepaald ontwikkelingsstadium biedt de mogelijkheid om te speculeren over de functie die dat noduline zou kunnen hebben. Op grond van de experimenten beschreven in de hoofdstukken vier en vijf kunnen vroege zowel als late noduline genen verder onderverdeeld worden in subklassen, die ieder correleren met een stap in de ontwikkeling van een wortelknol. Hoofdstuk zes, tenslotte, is een overzicht van de huidige kennis over nodulines, noduline genen en de regulatie van noduline genexpressie. De resultaten gepresenteerd in de hoofdstukken twee tot en met vi# worden in dit laatste hoofdstuk met deze kennis geïntegreerd.

Original languageEnglish
QualificationDoctor of Philosophy
Awarding Institution
Supervisors/Advisors
  • van Kammen, A., Promotor, External person
  • Bisseling, Ton, Co-promotor
Award date27 May 1988
Place of PublicationS.l.
Publisher
Publication statusPublished - 1988

Keywords

  • root nodules
  • nodulation
  • rhizobiaceae
  • rhizobium
  • genetics
  • genetic variation
  • evolution
  • speciation
  • immunogenetics

Cite this