Coupling of MgATP hydrolysis and electron transfer in the pre-steady-state phase of the nitrogenase reaction

R.E. Mensink

Research output: Thesisinternal PhD, WU

Abstract

Eén van de belangrijkste moleculen in de plantenwereld is ammoniak (NH 3 ). Uitgaande van ammoniak synthetiseert de plant biomoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren. Planten zelf zijn niet in staat moleculair stikstof (N 2 ) te reduceren tot ammoniak. De biologische reductie van N 2 tot NH 3 wordt bewerkstelligd door diazotrope bacteriën. Deze bacteriën bevatten het enzymcomplex nitrogenase. Nitrogenase bestaat uit twee zuurstofgevoelige metalloproteïnen die afzonderlijk geïsoleerd kunnen worden.

De grootste van deze metalloproteïnen is een α 2β2 -tetrameer. Elke αβ-unit functioneert als een onafhankelijke katalytische eenheid. De feitelijke reductie van N 2 vindt plaats op een ijzer-molybdeen cofactor (FeMoco). De voor de reductie benodigde elektronen worden in vivo geleverd door een ferredoxine of flavodoxine. Het MoFe-eiwit is niet in staat deze elektronen rechtstreeks op te nemen. In de katalytische cyclus van nitrogenase staat het ferredoxine of flavodoxine een elektron af aan de tweede component van het nitrogenase complex. Deze component is een Fe-eiwit, welk het elektron vervolgens aan het MoFe-eiwit doorgeeft.

Reductie van een metalloprotein door een ander metalloprotein is een veel voorkomende reactie in de biochemie. Het bijzondere van nitrogenase is dat elektronoverdracht slechts in aanwezigheid van magnesium-adenosinetrifosfaat (MgATP) optreedt. Experimenten verricht onder steady-state condities hebben laten zien dat per elektron dat naar een substraat wordt getransporteerd, er twee MgATP moleculen worden gehydrolyseerd. Geruime tijd bestond er onzekerheid over de vraag waar in de katalytische cyclus MgATP wordt gehydrolyseerd. In 1978 publiceerde de Brighton groep een experiment waaruit werd geconcludeerd dat de hydrolyse van MgATP en elektrontransport van het Fe-eiwit naar het MoFe-eiwit direct gekoppeld zijn. De gevonden ratio mol MgATP gehydrolyseerd/mol elektron overgedragen was gelijk aan 1. De auteurs interpreteerden dit resultaat als een aanwijzing dat elders in de katalytische cyclus ook MgATP wordt gehydrolyseerd.

De conclusie van de Brighton groep dat elektrontransport van het Fe-eiwit naar het MoFe-eiwit en de hydrolyse van MgATP gekoppeld zijn, werd algemeen aanvaard. Echter, een punt van discussie bleef de ratio mol MgATP gehydrolyseerd/mol elektron overgedragen. In 1980 verscheen een publikatie uit de groep van Burris waarin werd geconcludeerd dat deze ratio gelijk is aan 2, hetgeen impliceert dat de hydrolyse van MgATP alleen plaats vindt bij elektronoverdracht van het Fe-eiwit naar het MoFe-eiwit. Echter, in 1987 verscheen een publikatie van de vakgroep Biochemie uit Wageningen waarin werd gerapporteerd dat er 4 moleculen MgATP gehydrolyseerd kunnen worden per mol Fe- eiwit. Het Fe-eiwit heeft twee bindingsplaatsen voor MgADP of MgATP. Deze stoichiometrie impliceert dat er niet meer dan twee MgATP moleculen gehydrolyseerd kunnen worden per turnover van het Fe~ eiwit. Teneinde een ratio van 4 te kunnen verklaren, moest worden aangenomen dat twee extra bindingsplaatsen ontstaan wanneer het Fe-eiwit en MoFe-eiwit associëren.

Het doel van dit proefschrift was duidelijkheid te krijgen in de rol die MgATP vervult in de pre-steady-state ATPase activiteit van nitrogenase. In hoofdstuk 2 wordt een onderzoek beschreven waarin 2-azido-analogen van MgAMP, MgADP, en MgATP worden gebruikt om de nucleotide bindingsplaatsen binnen het nitrogenase complex te karakteriseren. Met deze experimenten zijn geen aanwijzingen verkregen dat in het nitrogenase complex nucleotide bindingsplaatsen bestaan naast die op het Fe-eiwit. Wel is duidelijk geworden dat Av2(ox) twee verschillende soorten bindingsplaatsen heeft die van belang zijn voor labellings experimenten met azido-nucleotiden. Een van de bindingsplaatsen heeft een affiniteit voor de azidogroep en wordt geïdentificeerd als het [4Fe-4S] cluster. De tweede bindingsplaats is specifiek voor MgADP en MgATP. Een deel van de gevormde bindingen wordt gereduceerd door 2-mercaptoethanol, hetgeen resulteert in verlies van label door het gemodificeerde eiwit.

In hoofdstuk 3 wordt aangetoond dat de door de Wageningse onderzoeksgroep gerapporteerde burst reactie van 4 moleculen MgATP gehydrolyseerd/mol Av2, veroorzaakt is door een apparaat artefact. Een herhaling van de experimenten met verbeterde rapid quench apparatuur gaf geen bevestiging van het algemeen aanvaard mechanisme waarin elektronoverdracht vooraf wordt gegaan door een volledige hydrolyse van MgATP. Er wordt ook op gewezen dat de gepubliceerde rapid-quench experimenten tegenstrijdige antwoorden geven op de vraag of elektronoverdracht voor dan wel na hydrolyse van MgATP plaats vindt. Tevens wordt beschreven hoe protonproduktie in de pre-steady-state fase van de nitrogenase reactie gevolgd kan worden met een stopped-flow spectrofotometrie techniek. Bij deze techniek wordt de kleursverandering van de pH- indicator cresol rood gebruikt om protonproduktie waar te nemen. De waargenomen snelheid van protonproduktie ligt lager dan die van elektronoverdracht.

In hoofdstuk 4 wordt de temperatuursafhankelijkheid van de MgATP-afhankelijke elektronoverdracht van het Fe-eiwit naar het MoFe-eiwit bekeken. De amplitude van het stopped-flow signaal is afhankelijk van de reactietemperatuur. Deze waarneming wordt verklaard door aan te nemen dat elektronoverdracht van het Feeiwit naar het MoFe-eiwit reversibel is. De snelheid van elektronoverdracht vertoont een interessante temperatuursafhankelijkheid. De resultaten zijn geanalyseerd in het kader van de transition- state theorie. Dit laat zien dat het geactiveerde complex gekarakteriseerd wordt door een uitzonderlijk hoge activeringsentropie. Deze waarneming is een aanwijzing dat elektronoverdracht gepaard gaat met een grote conformatieverandering binnen het nitrogenase complex.

In hoofdstuk 5 wordt bij 23 °C het effect bestudeerd van een hoge NaCl-concentratie op de extinctieverandering bij 430 nm, die gepaard gaat met elektrontransport van het Fe-eiwit naar het MoFe-eiwit. Net zoals een lage reactietemperatuur verlaagt NaCl deze extinctieverandering. Rapid-freeze EPR experimenten geven niet aan dat deze waarnemingen zonder meer verklaard mogen worden door een reversibele elektronoverdracht tussen beide nitrogenase eiwitten aan te nemen.

In hoofdstuk 6 van dit proefschrift is een algemene discussie van de resultaten gegeven. Er wordt geconcludeerd dat er in dit proefschrift geen eenduidige aanwijzingen zijn verkregen die aantonen dat volledige hydrolyse van MgATP noodzakelijk is voor elektronoverdracht tussen de nitrogenase eiwitten. Daarom wordt een alternatief gegeven voor modellen die in de literatuur zijn verschenen.

Original languageEnglish
QualificationDoctor of Philosophy
Awarding Institution
Supervisors/Advisors
  • Veeger, C., Promotor
  • Haaker, H., Promotor, External person
Award date10 Jan 1992
Place of PublicationS.l.
Publisher
Publication statusPublished - 1992

Keywords

  • nitrogenase
  • nitrogen fixing bacteria

Cite this