Biochemistry and bioenergetics of syntrophic propionate-oxidizing bacteria

Propionaat is één van de belangrijke tussenproducten die worden gevormd tijdens de anaërobe afbraak van complex organisch materiaal. In methanogene milieus, zoals zoetwatersedimenten en anaërobe bioreactoren, is de afbraak van propionaat tot acetaat kooldioxide en waterstof of formiaat een endergone omzetting onder thermodynamische standaardcondities. Dit betekent dat deze omzetting niet plaats kan vinden, tenzij de gevormde producten worden weggenomen. Het gevolg is dat propionaat wordt omgezet door zogenaamde syntrofe consortia, bestaande uit propionaat-oxiderende acetogene bacteriën en waterstof- of formiaat-consumerende methanogene archaea. Uit het Grieks vertaald betekent syntroof letterlijk "samen (syn) voedend (trophos)".

Gedetailleerde bestudering van het metabolisme van de propionaat-oxiderende acetogene bacteriën werd tot nu toe gehinderd door de noodzakelijke aanwezigheid van een waterstof- of formiaat-consumerende partner. Enkele jaren geleden echter werd duidelijk k dat syntrofe propionaat-oxiderende bacteriën ook zonder een methanogene partner kunnen groeien. Dankzij de groei van deze bacteriën in reinculturen werd het in dit proefschrift beschreven onderzoek waarbij biochemische en energetische aspecten van syntrofe propionaat-oxiderende bacteriën werden bestudeerd, mogelijk. In hoofdstuk 1 wordt een inleiding gegeven over syntrofie met speciale aandacht voor de syntrofe omzetting van propionaat. Tevens worden in hoofdstuk 1 eigenschappen gepresenteerd van de enzymen fumaraat reductase/ succinaat dehydrogenase, fumarase en malaat dehydrogenase, omdat deze enzymen werden gezuiverd uit de syntrofe propionaat-oxiderende bacterie stam MPOB, die als modelorganisme werd gebruikt tijdens dit onderzoek. Stam MPOB werd enkele jaren geleden geïsoleerd uit korrelslib van een anaërobe reactor waarmee afvalwater van een suikerfabriek werd gezuiverd. De bacterie is strikt anaëroob; dit betekent dat stam MPOB in aanwezigheid van zuurstof niet kan overleven. Stam MPOB werd geïsoleerd als een propionaat-omzettende syntrofe culture met methanogene archaea, maar kon in reinculture worden verkregen met behulp van het substraat fumaraat.

Tijdens de uitvoering van dit onderzoek werd bekend dat andere syntrofe propionaat- oxiderende bacteriën, namelijkSyntrophobacter woliniien S. pfennigii,de oxidatie van propionaat kunnen koppelen aan sulfaatreductie in reinculturen. In
hoofdstuk 2 wordt beschreven dat stam MPOB ook in staat is om sulfaat te reduceren. De groeisnelheid van stam MPOB met propionaat en sulfaat was, net als die van de twee Syntrophobacter soorten, erg laag vergeleken met de groeisnelheden van propionaat- oxiderende sulfaat-reducerende Desulfobulbus soorten.

Tijdens de oxidatie van propionaat komen bij drie tussenreacties reductieequivalenten vrij, namelijk bij de oxidatie van succinaat tot fumaraat, malaat tot oxaalacetaat, en pyruvaat tot acetyl-CoA. Deze reductie-equivalenten komen vrij in de vorm van waterstof of formiaat, welke vervolgens verwijderd moeten worden door methanogene archaea om de propionaat- oxidatie te kunnen laten voortgaan. Om de oxidatie van succinaat tot fumaraat te vergemakkelijken is het niet alleen van belang dat de waterstof of formiaat concentratie laag gehouden wordt maar ook de fumaraat concentratie. Hiervoor heeft de bacterie een fumarase nodig dat de omzetting van fumaraat tot malaat efficiënt katalyseert. De zuivering van dit enzym uit stam MPOB wordt beschreven in hoofdstuk 3. Het fumarase van stam MPOB bleek instabiel te zijn in aanwezigheid van zuurstof en werd daarom gezuiverd onder anaërobe condities in een anaërobe tent. Het enzym bestaat uit twee subunits die elk een moleculaire massa van 60 kDa hebben. De N-terminale aminozuurvolgorde van het fumarase van stam MPOB vertoonde duidelijke overeenkomsten met onder andere die van twee fumarases uit Escherichia coli. Met behulp van elektron paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie werd de aanwezigheid van een [4Fe-4S] cluster in het fumarase van stam MPOB aangetoond. Dit cluster reageert met het substraat fumaraat. De katalytische eigenschappen van het fumarase lieten zien dat het enzym efficiënter fumaraat omzet tot malaat dan andersom. Dit is belangrijk voor de vergemakkelijking van de energetisch ongunstige succinaat-oxidatie tijdens de omzetting van propionaat.

In hoofdstuk 4 wordt de zuivering en karakterisering beschreven van het malaat dehydrogenase van stam MPOB. Dit enzym katalyseert één van de tussenreacties tijdens de syntrofe propionaat-oxidatie waarbij reductie-equivalenten vrijkomen, namelijk de NAD- afhankelijke omzetting van malaat naar oxaalacetaat. Het malaat dehydrogenase van stam MPOB bestaat uit twee subunits met een moleculaire massa van elk 35 kDa. De N-terminale aminozuurvolgorde van het enzym bevatte het geconserveerde gebied dat in de meeste malaat dehydrogenases, van zowel planten, dieren als micro-organismen, voorkomt. De affiniteit van het enzym voor oxaalacetaat en NADH was hoger dan de affiniteit voor malaat en NAD, terwijl het enzym in de cel de omzetting van malaat tot oxaalacetaat katalyseert. Dit is mogelijk de reden voor de bijzonder hoge specifieke activiteit van het gezuiverde malaat dehydrogenase van stam MPOB (1728 U/mg eiwit).

De zuivering van het fumaraat reductase uit stam MPOB, beschreven in hoofdstuk 5, verliep erg moeizaam, hetgeen voornamelijk werd veroorzaakt door de zuurstofgevoeligheid van het enzym en het feit dat het een membraan-gebonden enzym betrof. Het gezuiverde enzym bevatte drie subunits die qua moleculaire massa, namelijk 70,5, 33,5 en 23,5 kDa, overeenkwamen met reeds bekende fumaraat reductases en succinaat dehydrogenases. Ook op grond van de N-terminale aminozuurvolgorde van de twee grootste subunits kon gezegd worden dat het fumaraat reductase van stam MPOB verwant is aan fumaraat reductases en succinaat dehydrogenases van andere micro-organismen. De meeste andere bekende fumaraat reductases en succinaat dehydrogenases bevatten drie verschillende ijzer-zwavel clusters, namelijk een [2Fe-2S], [4Fe-4S] en [3Fe-4S] cluster. Met behulp van EPR- spectroscopie konden deze drie clusters worden aangetoond in membranen van stam MPOB. In het gezuiverde fumaraat reductase konden echter alleen het [2Fe-2S] cluster en het [4Fe-4S] cluster worden aangetoond. Het signaal van het [4Fe-4S] cluster was bovendien erg zwak. Mogelijkerwijs zijn de [3Fe-4S] en [4Fe-4S] clusters gedeeltelijk verloren gegaan tijdens de zuiveringsprocedure, of na blootstelling aan zuurstof gedeeltelijk afgebroken.

De oxidatie van succinaat tot fumaraat en waterstof of formiaat is verreweg de energetisch ongunstigste tussenreactie tijdens syntrofe propionaat-oxidatie. Omdat deze reactie zelfs bij de voor methanogene archaea laagst haalbare waterstof- of formiaat- coneentraties nog steeds endergoon is, wordt verondersteld dat de bacterie energie moet investeren in de oxidatie van succinaat. Men denkt dat de elektronen die bij de oxidatie van succinaat vrijkomen, via een omgekeerd elektronentransport naar een lagere redox potentiaal moeten worden geleid waarbij de elektronen wel gekoppeld kunnen worden aan de reductie van protonen of bicarbonaat. Het omgekeerd elektronentransport zou worden gedreven door de hydrolyse van2/3ATP.
Uit groeistudies met stam MPOB, gekweekt op fumaraat met waterstof of formiaat als elektronendonor (hoofdstuk 6), is gebleken dat de bacterie ongeveer 2/3ATP verkrijgt uit de reductie van 1 mol fumaraat. Deze waarde ondersteunt de hypothese dat de bacterie in de omgekeerde reactie 2/3 ATP moet investeren. In hoofdstuk 6 wordt tevens de lokalisering beschreven van enkele enzymen die betrokken zijn bij de reductie van fumaraat De enzymen fumaraat reductase, succinaat dehydrogenase en ATPase zijn gebonden aan de cytoplasmatische membraan. Hydrogenase en formiaat. dehydrogenase zijn slechts zwak geassocieerd met deze membraan, waarschijnlijk aan de periplasmatische zijde. Daarnaast wordt in hoofdstuk 6 beschreven dat stam MPOB twee typen menaquinonen bevat, menaquinon-6 en -7, en twee typen cytochromen, namelijk b-type cytochromen in de membraanfractie en c -type cytochromen in de oplosbare celfractie Er zijn aanwijzingen gevonden dat cytochroom b en menaquinon onderdeel zijn van de elektronentransportketen tijdens de reductie van fumaraat Indien de oxidatie van succinaat in stam MPOB gekoppeld is aan een omgekeerd elektronentransportmechanisme is het waarschijnlijk dat hierbij de elektronen-transportketen die betrokken is bij de reductie van fumaraat, in omgekeerde richting wordt gebruikt. Helaas konden hier tot dusver alleen enkele indirecte aanwijzingen voor worden verkregen. Omdat het niet is gelukt om van stam MPOB actieve membraanvesikels te maken, was het niet mogelijk om het effect van ionoforen en ATPase-remmers te bestuderen op de waterstofproductie uit de omzetting van succinaat tot fumaraat. Alleen met dergelijke experimenten is het mogelijk om te bewijzen dat de succinaat-oxidatie tijdens syntrofe propionaat-oxidatie wordt gedreven door een energieverbruikend omgekeerd elektronentransport.

Hoofdstuk 7 beschrijft de fysiologische karakterisering van stam MPOB. Stam MPOB wordt gezien als een nieuwe soort van het geslacht Syntrophobacter. Voor stam MPOB wordt de naam Syntrophobacter fumaroxidans voorgesteld, omdat de bacterie in reinculture kon worden verkregen dankzij zijn groei met fumaraat

Tenslotte worden in hoofdstuk 8 de voorafgaande hoofdstukken samengevat en bediscussieerd.